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TECHNOZYM
vWF:CBA ELISA
PRODUKTBESCHREIBUNG
ANWENDUNG
Von Willebrand Faktor (vWF) ist ein großes, multifunktionelles Glykoprotein mit einer Schlüsselstelle in
der primären Hämostase. Er liegt in multimerer Struktur vor und hat mehrere Funktionen:
Er ist das Trägerprotein für Faktor VIII im Plasma; er bildet einen Komplex und schützt so Faktor
VIII vor vorzeitigem proteolytischem Abbau.
Er vermittelt die Plättchenaggregation über die Anhaftung an Plättchen-
membranrezeptoren (GP Ib GP IIb/IIIa) nach vorausgegangener Plättchenaktivierung.
Er spielt eine Rolle bei der primären Hämostase durch Vermittlung
der Plättchenadhäsion an das Subendothel (verletzte Gefäßwand).
Bei der Charakterisierung der adhäsiven Eigenschaften wird üblicherweise die Plättchenaggregation
untersucht (Meßsystem = Ristocetinabhängige Plättchenaggregation). Diese spiegelt jedoch nicht die
physiologische Situation und Funktion des vWF wieder.
Zur Erfassung der adhäsiven Eigenschaften des vWF nutzt man die Bindung des vWF zu Collagen. Die
Bestimmung einer vWF-Collagen Bindung entspricht der physiologischen Funktion des vWF.
ZUSAMMENSETZUNG
1. ELISA-Teststreifen (12): mit jeweils 8 Testvertiefungen; beschichtet mit humanem Collagen Typ III;
mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel verpackt.
2. Waschpufferkonzentrat: (PBS;pH7,3); detergenshaltig; 0,01% Merthiolat; 1Flasche; 80 mL.
3. Inkubationspuffer: (PBS; pH 7,3); gefärbt enthält Stabilisatorprotein; Proclin 300, 1 Flasche; 90 mL;
gebrauchsfertig
4. Kalibratoren (Standards): Nummeriert; lyophilisiert; jeweils eine Flasche.
Die chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten !
5. Kontrollplasmen "high level" und "low level":zur Richtigkeitskontrolle; lyophilisiert; jeweils eine
Flasche.
Die chargenabhängigen Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Flaschenetiketten !
6. Konjugat: Polyklonaler Anti-vWF-POX; blaugefärbt; 1 Flasche; 0,3 mL
7. Chromogenes Substrat: TMB (Tetramethylbenzidin) 1 Flasche, 12 mL, gebrauchsfertig
8. Stopplösung: Schwefelsäure 1,9 mol/L; 1 Flasche; 12 mL, gebrauchsfertig
9. Abklebefolien: für ELISA-Teststreifen, 2 Stück
BENÖTIGTES MATERIAL
(nicht im Testkit enthalten)
1. Aqua dest
2. Röhrchen zur Verdünnung der Standards und Proben
3. Messzylinder (1000 mL)
4. Präzisionspipetten (10, 100 und 1000 µL)
5. Variable Pipette (1000µL)
6. Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten (100 und 200 µL)
7. ELISA-Waschgerät oder Mehrkanalpipette
8. ELISA-Reader mit 450 nm Filter (und 620 nm Referenzfilter falls verfügbar)
LAGERUNG UND STABILITÄT
Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Die
Haltbarkeit der Komponenten nach Öffnung, Rekonstitution bzw. Verdünnung können Sie der
folgenden Tabelle entnehmen.
Falls nötig, können Proben, Kontrollen und Kalibratoren fünfmal eingefroren und wieder aufgetaut
werden, das Herstellen von geeigneten Aliquots ist jedoch empfehlenswerter.
Material/Reagenz
Zustand
Kalibratoren,
nach Rekonstitution
Kontrollplasmen
ELISA-Teststreifen
nach Öffnen
Waschpuffer- Konzentrat
nach Öffnen
1+11,5
Verdünnung
Waschpuffer
des Konzentrats
Inkubationspuffer
nach Öffnen
nach Öffnen
Konjugat
Gebrauchslösung
Chromogenes Substrat
nach Öffnen
TESTDURCHFÜHRUNG
VORBEREITUNG DER PLASMAPROBEN
Probenmaterial: Plasma
Plasmagewinnung: 9 Teile Venenblut mit 1 Teil Natriumcitratlösung (0,11 mol/L) mischen und 15 min
bei einer RZB von mindestens 2500 zentrifugieren (DIN 58905). Die Plasmaprobe kann 3 Stunden bei
Raumtemperatur aufbewahrt werden, andernfalls sollte die Probe sofort nach Zentrifugation eingefroren
werden. Haltbarkeit –20°C: 6 Monate.
VORBEREITUNG DES REAGENZES
1. Vor Testbeginn alle benötigten Testkomponenten auf Raumtemperatur bringen.
2. Herstellen des Waschpuffers: 1 Volumenteil Waschpufferkonzentrat mit 11,5 Volumenteilen Aqua
dest. verdünnen (1+11,5). Gut mischen! (Verdünntes Waschpufferkonzentrat = Waschpuffer).
Eventuelle kristalline Niederschläge gehen bei 37°C innerhalb von 10 min in Lösung.
3. Rekonstituieren der Kalibratoren und Kontrollplasmen: Die Kalibratoren und Kontrollplasmen werden
mit 500 µl Aqua dest. rekonstituiert und nach einer Rekonstitutionszeit von 15 Minuten 10 Sekunden
gemischt (Probenmischer). Rekonstituierte Komponenten sind klar bis leicht trüb.
4. Verdünnen der Kalibratoren, Kontrollplasmen und der Proben (1+25): 20 µL Probe, 20 µL
Kalibratoren bzw. 20 µL Kontrollen jeweils mit 500 µL Inkubationspuffer verdünnen. 10 Sekunden
mischen!
5. Herstellen der Konjugatgebrauchslösung (1+50): 1 Volumenteil Konjugat mit 50 Volumenteilen
Inkubationspuffer verdünnen.
Für 8 Testvertiefungen: 20 µL Konjugat mit 1000 µL Inkubationspuffer mischen.
TESTVERFAHREN
Verdünnte
PROBENINKUBATION
Proben in Testvertiefungen pipettieren.
(Hinweise 1,2)
Teststreifen mit Folie abdecken
Bei Raumtemperatur inkubieren
WASCHEN (Hinweise 1,3,4)
Waschpuffer
Konjugatgebrauchslösung in Testvertiefungen
KONJUGATREAKTION
pipettieren. Teststreifen mit Folie abdecken
(Hinweise 1,2)
Bei Raumtemperatur inkubieren
WASCHEN (Hinweise 1,3,4)
Waschpuffer
Substratlösung in Testvertiefungen pipettieren,
SUBSTRATREAKTION
Teststreifen mit frischer Folie abdecken
(Hinweis 1,2)
Bei Raumtemperatur inkubieren
STOPPEN (Hinweis 1,2)
Stopplösung in Testvertiefungen pipettieren
MESSEN (Hinweis 5)
ELISA-Reader, 450nm
Lagerung
Stabilität
Raumtemperatur
8 Stunden
-20°C
6 Monate
2 ... 8 °C mit Abklebefolie in
Verfallsdatum
Alubeutel mit Trockenmittel
2 ...8°C
6 Monate
2 ... 8 °C
3 Wochen
2 ... 8 °C
2 Monate
2 ... 8 °C
6 Monate
Raumtemperatur
60 Minuten
2 ... 8 °C
Verfallsdatum
Kalibratoren,
Kontrollplasmen,
100 µL
45 Minuten
3x200 µL
100 µL
45 Minuten
3x200 µL
100 µL
15 Minuten
100 µL
Hinweise
1. Reagenzien verschiedener Chargen dürfen nicht kombiniert werden.
2. Präzision und Wiederfindung hängen u.a. von folgenden Faktoren entscheidend ab:
Gute Durchmischung aller Verdünnungsansätze, 10 Sek. Auf Probenmischer
Durchführung von Doppelbestimmungen
Inkubation bei der korrekten Temperatur (Raumtemperatur: 20...25 °C)
Genaue Einhaltung von Pipettierreihenfolge und Zeittakt:
Die angegebene Zeit für die Probeninkubation, Konjugat- und Substratreaktion wird nach der
Pipettierung der letzten Probe genommen. Inkubationszeiten sollten um nicht mehr als ± 10%
variiert werden.
Bei der Probeninkubation und Konjugatreaktion darf die Zeit für die Pipettierung der verdünnten
Kalibratoren/ Proben/ Kontrollplasmen bzw. Konjugat-Lösung 60 Sek. pro ELISA-Teststreifen (8
Vertiefungen) nicht überschreiten.
Bei der Substratreaktion und beim Stoppen darf die Pipettierzeit der Substrat- bzw. Stopplösung 10
Sek. pro ELISA-Teststreifen nicht überschreiten. Kurze Pipettierzeiten werden durch Verwendung
von Mehrkanal- bzw. Dispensierpipetten erreicht.
3. Teststreifen mit wasserfestem Stift markieren, falls sie während des Testes versehentlich aus der
Halterung fallen sollten.
4. Nach dem letzten Waschvorgang müssen die Testvertiefungen leer gesaugt und auf saugfähigem
Papier ausgeklopft werden.
5. Durch Differenzwellenlängenmessung bei 450 nm und 620 nm (oder 690nm) wird die Präzision des
Tests erhöht.
6. 10 Sek. Schütteln, Messung innerhalb von 10 Minuten
EINSCHRÄNKUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG
Verminderte Spiegel von vWF:CBA sind mit der Blutgruppe 0 vergesellschaftet.
vWF:CBA wird auch beeinflusst durch körperliche Arbeit, Schwangerschaft (durch orale Kontrazeptiva),
ethnische Zugehörigkeit und durch den altersbedingten Antigen Anstieg.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
-
Alle humanen Blut- bzw. Plasmaprodukte und Proben müssen als potentiell infektiös angesehen
werden. Sie sind mit der notwendigen Sorgfalt und entsprechend den Sicherheitsvorschriften zu
behandeln und wie Krankenhausmüll zu entsorgen. Die Kalibratoren und Kontrollen, hergestellt aus
humanem Blut, und jedes hierzu verwendete Einzelplasma ist HbsAg, HIV Ak und HCV-Ak negativ
(siehe Außen- bzw. Flaschenetikett).
-
Stopplösung (Schwefelsäure) kann zu Reizungen der Haut führen. Sollte Säure in die Augen
gelangen, sofort mit viel Wasser auswaschen und einen Arzt aufsuchen!
-
Die Reagenzien enthalten teilweise Konservierungsmittel (Merthiolat). Nicht schlucken! Haut- oder
Schleimhautkontakt vermeiden !
ANALYSENERGEBNISSE
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Erstellung der Bezugskurve:
X-Achse: Konzentration vWF:CBA U/ml (1 U/mL = 100%)
Y-Achse: Extinktion
Bezugskurve ist linear-linear, Werte sind punkt zu punkt oder mit „ cubic spline"
Beurteilung der Bezugskurve
Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte zwischen 1,0 und 2,5 liegen.
Die Auswertbarkeit des Tests kann anhand der ermittelten Kontrollwerte überprüft werden
Beispiel einer Standardkurve:
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,2
0,4
0,6
vWF:CBA U/ml
Konzentrationsbestimmungen der Proben
Konzentrationen der Proben an der Bezugskurve ablesen.
Sollte der Extinktionswert einer Probe höher als der des höchsten Standards liegen, so muss
die Probe mit Inkubationspuffer vorverdünnt werden (1+1). Die ermittelte Konzentration wird in
diesem Fall mit dem Verdünnungsfaktor 2 multipliziert.
REFERENZBEREICHE
Der Normalbereich von vWF:CBA liegt zwischen 0,4 – 2,5 U/mL (40-250%) (Fig 1)
Es wird empfohlen, dass jedes Labor einen eigenen Normalbereich bestimmt.
STANDARDISIERUNG
Das verwendete Kalibrationsmaterial ist der WHO International Standard für den Gerinnungsfaktor VIII
und den vWF in humanem Plasma.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN
Nachstehend werden repräsentative Leistungsdaten angezeigt. Die Ergebnisse des einzelnen Labors
können davon abweichen.
PRÄZISION
Die reproduzierbarkeit wurde mit verschiedenen Proben (in der Serie und von Tag zu Tag) bestimmt.
Die Resultate gehen aus nachstehender Tabelle hervor:
Intra assay
Sample 1
N
24
Mean (U/mL)
1,372
SD (U/mL)
0,020
CV (%)
1,47%
METHODENVERGLEICH ODER KORRELATION
Der Technozym vWF:CBA (Technoclone) wurde mit 2 tests verglichen. Es wurden 113 proben (24
Proben von Normalspendern und 89 Proben von Patienten mit vWD, klassifiziert als Typ 1 (n=26), Typ
2A/2B (n=11), Typ 2M (n=45), Typ 2N (n=4) und Typ 3 (n=3)) gemessen.
Mit dem Asserachrom vWF:CB von Stago (verwendet humanes Collagen Typ III) konnte eine
Korrelation von r=0.98 mit einer Steigung=0.90 festgestellt werden. Mit dem Collagen Binding Assay
von Life Diagnostics (verwendet equines Collagen mit 95% Typ I und 5% Typ III) konnte eine
Korrelation von r=0.99 mit einer Steigung = 0.95 festgestellt werden,
MESSBEREICH
0.01
– 1.70 U/mL
Der Messbereich jedes Tests hängt vom tatsächlichen Wert des Kalibrators 1 ab.
BESTIMMUNGSGRENZE
0.01 U/mL
LITERATUR
1) Blood 69; 1691 – 1695, 1987. The effect of ABO blood group on the diagnosis of vWD. Gill et al.
2) Thromb Haemost 2000; 83: 127 – 35. Collagen Binding Assay for von Willebrand Factor (VWF:CBA) Detection
of VWD and discrimination of VWD Subtypes, Depends on Collagen Source. E J Favaloro
3) Haemophilia (Suppl. 3), 1998, 15 – 24. The determination of von Willebrand factor activity by collagen binding
assay. Siekmann et al.
3 / 8
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Inter assay
Sample 2
Sample 1
24
10
1,630
1,366
0,029
0,074
1,75%
5,39%
DE
Sample 2
10
0,306
0,013
4,13%
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